細胞分離
- FG beadsの分離方法(磁気分離と遠心分離)を教えてください。
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バックグラウンドを抑える（非特異的な吸着を少なくする）ために、固定化やスクリーニングの実験では以下の注意が必要です。
リガンド固定化時
遠心分離を行う。
FG beadsはナノサイズのため分散性が高くなっています。そのため、有機溶媒中では磁気分離が困難なので、遠心分離でFG beadsを回収する必要があります。
アフィニティ精製時(スクリーニング)
磁気分離を行う。
遠心分離を行うと重いタンパク質や不溶性のタンパク質も一緒に沈殿してしまい、バックグラウンドが高くなってしまいます。FG beadsは分散性が高いため磁気分離に時間がかかりますが（５分以上必要とする場合もあります）、磁気分離を行うことでこれらの不純物混入のリスクを回避することができ、バックグラウンドが低いきれいな結果を得ることができます。
- FG beadsの分散方法(超音波法とガリガリ法)を教えてください。
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バックグラウンドを抑える（非特異的な吸着を少なくする）ために、固定化やスクリーニングの実験では以下の注意が必要です。
リガンド固定化時
良く分散させる。
遠心分離を行うとFG beadsが強く凝集するので、分散させにくくなります。低分子化合物の固定化では、超音波分散機による分散（超音波ホモジナイザーまたは超音波洗浄器等を使用）、タンパク質の固定化ではガリガリ法での分散を推奨しています。ガリガリ法は、プラスチック製の試験管立てにマイクロチューブの底をあててガリガリと動かして分散させる方法です。ガリガリ法にて分散しにくい場合は、氷冷した超音波分散機で短時間で分散させてください。
ガリガリ法にて分散させる場合、マイクロチューブの種類によっては底が割れたり蓋の部分から漏れたりする場合があります。硬くて蓋がきつく閉まるマイクロチューブをお使いください。弊社ではキャップロックの使用を推奨しています。
アフィニティ精製時(スクリーニング)
良く分散させる。
タンパク質と結合反応後のFG beadsの洗浄操作で分散が不十分な場合、ビーズの塊の中に不純物が残る可能性があります。そのため、FG beadsをよく分散させる必要があります。FG beadsはガリガリ法で分散させます。
- 抗体を固定化させる際に最適なビーズはどれですか？
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非特異的吸着を抑えたい場合には、NHS beadsを使用し、抗体を直接ビーズに固定化します。NHS beadsは解析時に抗体の遊離が少ないという利点があります。
ただし、抗体のリジン残基とビーズ表面のNHS基で共有結合させるため、配向がランダムになります。抗体の配向をそろえたい場合や抗原の回収量を増やしたい場合には、Protein A beads、Protein G beadsをご使用ください。
また、ビオチン化した抗体をお持ちの場合はStreptavidin beads、NeutrAvidin beadsへの固定化が可能です。
- 抗体の固定化量を定量する方法はありますか？
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固定化量の定量は、固定化後のビーズの直接定量にて行うことができます。方法は、当社サイト内のプロトコールの107をご参照ください。
- 抗体の固定化効率はどのくらいになりますか？
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使用するビーズの種類により異なりますので、下記製品情報ページをご参照ください。
- 抗体の固定化効率(固定化量)を上げる方法はありますか？
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いくつかの方法があります。下記をご参照ください。
①NHS beadsの場合は、固定化反応時間を長くすることで固定化量が増える場合があります。ただし、NHS基は加水分解を受けやすく、非特異的吸着の要因となるため、4時間以内としてください。
②NHS beadsの場合は推奨固定化バッファ以外の組成によって固定化反応が阻害される場合があります。抗体保存溶液に塩やグリセロールなどの添加物が含まれる場合はバッファ置換を行うことで固定化効率が上がります。
③固定化反応時の抗体添加量を上げることで固定化量が増加します。
- 抗体固定化ビーズの分散には超音波を使用しても良いですか？
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ビーズの分散はガリガリ法（プラスチック製の試験管立てにマイクロチューブの底をあててガリガリと動かして分散させる方法）を推奨しています。超音波による分散を実施される場合は、氷冷下、断続的に超音波を当ててください。ガリガリ法については動画をご参照ください。
- 固定化反応の際、チューブ壁面へビ－ズが付着してしまうことがありますが、抑える方法はありますか？
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下記の方法で改善する場合があります。
- タンパク質低吸着チューブを用いる。
- 攪拌を転倒混和でなくマイクロチューブミキサーによる攪拌にする。
- 固定化反応後に、ガリガリ法（プラスチック製の試験管立てにマイクロチューブの底をあててガリガリと動かして分散させる方法）でビーズを分散させ、遠心（磁気）分離を行う。
- 抗体固定化後のビーズの分散性を向上させたいのですが、どうしたらよいですか？
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抗体やタンパク質を固定化すると、ビーズが沈殿しやすくなることがあります。使用前にビーズをよく分散させて使用頂ければ問題ありませんが、更に分散性を向上したい場合、保存バッファ中から塩を除くことで分散性が向上します。
