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- ラインナップ以外の粒子径のビーズは作製可能ですか？
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ラインナップ品以外の粒子径のビーズ作製は行っておりません。
- リガンドをビーズに固定化するプロセスの概要を教えてください。
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NHS beadsにリガンドとして化合物を固定化する場合、 固定化反応は仕込濃度を4点（0, 0.1, 0.3, 1 mM)振り、最適濃度を検討します。リガンドの固定化量は、そのリガンドの性質によって異なります。 固定化量は、およそ数nmolから100nmol程度です。良い精製結果を得るためには、数nmolから数十nmolがよく、固定化量は多すぎると立体障害となります。その他のビーズを使用する方法については、各種プロトコールをご確認ください。
- どのぐらいのビーズの量が必要ですか？
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20mgのビーズでアフィニティ精製の条件検討2回分です。条件検討の後、さらに精製した標的タンパク質等をある程度の量を確保するためには約50mgのビーズが必要になります。
- リガンドをデザインする際の注意点を教えてください。
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結合タンパク質を探索したい原化合物に対して官能基を導入してリガンドをデザインする場合、 官能基を導入する部位によって精製される結合タンパク質が異なるため、 1つの原化合物に対してFG beadsへの固定化部位の異なる複数のリガンドをデザイン・固定化してアフィニティ精製することをお勧めします。
- 2級アミンを固定化できますか？
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NHS beadsに固定化できます。ただし、1級アミンと2級アミンが共存している場合は、1級アミンの方が選択的に反応が進行します。
- リガンド固定化の成否を判断するための方法は、HPLC以外にありますか？
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実際にタンパク質を結合させて判断します。固定化濃度0 mMではタンパク質の結合が無く、固定化濃度の増加に従いタンパク質のバンドが増加していれば、上手く固定化されていると判断します。
- 精製効率はどのくらいですか？
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アフィニティの強いリガンドを用いた場合、当社の検討結果では精製効率はおよそ50%です。しかし、個々のリガンドの性質に負うところが大きく、状況に応じて異なります。
- タンパク質を固定化させる際に最適なビーズを教えてください。
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NHS beadsが最適です。タンパク質のリジン残基中のε-NH2基とビーズ表面のNHS基とで固定化します。His-tagタンパク質の場合は、Ts beadsへの固定化が可能です。
免疫沈降について：https://fgb.tamagawa-seiki.com/selection/immunoprecipitation
- タンパク質の固定化効率はどのくらいですか？
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タンパク質により異なりますが、タンパク質50μgをNHS beads1mgへ仕込み固定化を行うと、10～40μg程度が固定化されます。反応時間を長くしたり、仕込量を増加させることで、さらに固定化量を増やすことが可能です。
- 細胞破砕液の調製方法を教えてください。
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当社では、Dignam法を推奨しています。ただしDignam法は細胞量を必要とするため、少量で行う場合はNP-40等の界面活性剤で可溶化する方法を推奨しています。当社サイト内のプロトコールのページから401および402のプロトコールをご参照ください。
上記が困難な場合、市販のキット（ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit（MERCK MILLIPORE）、CelLytic M（SIGMA）、等）も使用可能です。但し、界面活性剤の濃度が1％以上の場合、アフィニティ精製中にリガンドが標的タンパク質に結合するのを妨げる可能性がありますので、使用前に透析や希釈により界面活性剤濃度を0.1％に下げてください。
- 細胞破砕液は冷凍ストック品でも問題ありませんか？
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細胞破砕液は冷凍ストック品でも問題ありません。ただし使用前に遠心分離を行い、不溶物質（変性タンパク質など）を取り除いてください。
- タンパク質の供給源はどのくらい必要になりますか？
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血清タンパク質、また培養細胞や組織の抽出物が適用可能です。培養細胞をタンパク質の供給源とする場合、核内タンパク質で109個程度、細胞質タンパク質で107〜109個が必要です。
- 結合タンパク質のバンドが数多く検出された場合はどうしますか？
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競合阻害実験、ドラッグエリューションを行い、そのリガンドに対して特異的なバンドかどうかを確認する必要があります。リガンド結合量を減らす、またはバッファーの組成を変えることにより特異性の高いタンパク質を絞り込むことも可能です。
また活性有無のリガンド固定化ビーズを使用することで、標的タンパク質を絞りやすくなります。
- 結合バッファは推奨バッファを用いる必要がありますか？
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HEPESの代わりにTBS、KClの代わりにNaClを使用しても問題ありません。
- 溶出の際に、塩溶出とボイル溶出を両方行っているのはなぜですか？
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ある程度弱い結合（塩の力で外れる結合）と強い結合（サンプルバッファ+加熱で外れる結合）を分けているためです。ボイル溶出のみを行って頂いても問題ありません。
- リガンドの仕込濃度を増やした際に結合タンパク質のバンドが薄くなることはありますか？
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リガンド固定化量を増やした際にビーズが疎水性になり凝集しやすくなるため、タンパク質との反応効率が低下しバンドが薄くなる可能性があります。ビーズの凝集が見られる場合は、リガンド固定化量を減らしてください。
- 結合タンパク質のバンドが全く見られないのですが？
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リガンド固定化量が少ない可能性がるため、固定化濃度を増やして検討してください。リガンドと標的タンパク質のアフィニティが弱いことも考えられるため、バッファの塩濃度を下げてみてください。
またタンパク質溶液中に標的タンパク質の存在量が少ない場合は、タンパク質溶液の濃度または液量を増やすことを検討する必要があるかもしれません。
- 結合反応時間は4時間が最適ですか？
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当社の経験上、4時間で十分ですが、ビーズに固定化したリガンドと標的タンパク質の性質によるため検討いただくことをお勧めします。
- 抗体を固定化させる際に最適なビーズはどれですか？
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非特異的吸着を抑えたい場合には、NHS beadsを使用し、抗体を直接ビーズに固定化します。NHS beadsは解析時に抗体の遊離が少ないという利点があります。
ただし、抗体のリジン残基とビーズ表面のNHS基で共有結合させるため、配向がランダムになります。抗体の配向をそろえたい場合や抗原の回収量を増やしたい場合には、Protein A beads、Protein G beadsをご使用ください。
また、ビオチン化した抗体をお持ちの場合はStreptavidin beads、NeutrAvidin beadsへの固定化が可能です。
- 抗体の固定化量を定量する方法はありますか？
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固定化量の定量は、固定化後のビーズの直接定量にて行うことができます。方法は、当社サイト内のプロトコールの107をご参照ください。
- 抗体の固定化効率はどのくらいになりますか？
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使用するビーズの種類により異なりますので、下記製品情報ページをご参照ください。
- DNAを固定化させるのに最適なビーズはどれですか？
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1本鎖および2本鎖DNAはPlain beadsに固定化できます。詳細はプロトコールをご確認ください。
- RNAの固定化法を教えてください。
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末端に適当な官能基（NH2基、SH基など）を導入した合成RNAを固定化する、または、あらかじめDNAを固定化しておき、ハイブリダイゼーションによりPlain beadsへRNAを結合させます。
- 質量分析(MS)で結合タンパク質を解析したいのですが標的タンパク質のバンドが薄い場合は、どうしたらよいですか？
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アフィニティ精製のスケールを上げる(例 2.5mg/1000μL)、または同じ条件で本数を増やしてアフィニティ精製を実施してください。
- どのくらいのタンパク質量があればMSで解析可能ですか？
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使用する装置の種類によりますが、50 ng程度のタンパク質量があれば解析可能です。
